俄罗斯专享会294 旨在学习使用CaCl2法制备大肠杆菌的感受态细胞，以便于未来的基因转染实验。本文将详细介绍该方法的基本原理、所需器材、试剂以及操作步骤，帮助实验人员熟练掌握该技能。

一、研究目的

本实验的目的是掌握通过CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的技巧，以提高细胞对外源DNA的吸收能力。

二、实验原理

在0℃ CaCl2低渗溶液中，细菌会膨胀成球形并失去部分膜蛋白，这使得细胞易于吸收外源DNA，从而增强转化效率。

三、所需器材

本实验所需器材包括：旋涡混合器、微量移液取样器、移液器吸头（需灭菌处理）、50ml和15ml微量离心管、双面微量离心管架、台式冷冻离心机、制冰机、恒温摇床、分光光度计、超净工作台、恒温培养箱、摇菌试管、三角烧瓶及接种环。

四、试剂准备

实验所需试剂包括：E. coli XL1-Blue菌株、LB培养基、0.1 mol/L CaCl2溶液和无菌ddH2O。

五、实验准备

准备工作包括：将15ml离心管放在铝制饭盒内（灭菌处理）、将移液器吸头装入灭菌吸头盒，准备平板培养基和LB液体培养基，并确保它们已经灭菌，此外还需准备冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液、无菌ddH2O、摇菌试管和三角烧瓶（均需灭菌）。

六、操作步骤

1. 在超净工作台中，将2ml LB（不含抗生素）培养基加入无菌摇菌试管中。
2. 从超低温冰柜中取出XL1-Blue菌种并放在冰上，利用烧红的接种环插入冻菌中并移至含有2ml LB培养基的试管中，在37℃下摇床培养过夜。
3. 从上一步的培养液中取0.5ml转接到含50ml LB培养基的三角烧瓶中，在37℃下以250rpm摇床培养2-3小时，并测定OD600为0.375（<0.4-0.6，细胞数＜1x10^8/ml，此为关键参数！）。
4. 将菌液分装到预冷的无菌聚丙烯离心管中，置于冰上10分钟，然后以4℃，5000rpm离心10分钟。
5. 倒置离心管以去除上清液，加入1ml冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液，立即在涡旋混合器上充分混匀，并置于冰上30分钟。
6. 进行一次4℃，5000rpm离心10分钟，弃去上清液，用1ml冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液重新悬浮，放入冰中静置30分钟。
7. 再次进行4℃，5000rpm离心10分钟，去除上清液后，用200μl冰冷的0.1 mol/L CaCl2溶液悬液，按每管100ml分装到15ml离心管中。这些感受态细胞可直接用于转化实验，或放入-80℃超低温冰柜中保存数月。
8. 在处置细菌可能污染的桌面时，喷洒70%乙醇并擦干桌面以确保生物安全。

通过上述步骤，实验人员可以成功制备大肠杆菌感受态细胞，为后续的基因操作实验打下坚实的基础，同时在实验过程中始终注重操作的无菌性，以确保实验结果的准确性与有效性。