俄罗斯专享会294的细胞冻存技术是一种用于长期保存细胞的重要方法。该过程通过将细胞置于低温环境中，显著降低细胞的代谢活动，以便为后续实验或临床应用保留细胞资源。一般而言，细胞冻存遵循慢冻原则，这一原则有助于细胞逐步脱水，防止因大冰晶形成而对细胞造成损伤。

原理

当温度降至-70℃时，细胞的生化代谢活动与酶活性几乎完全停止，而低于-130℃时，细胞的存活率达到最佳。液氮是实现细胞长期保存的理想选择。采用的冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO）能够迅速穿透细胞膜，降低冰点，延缓冷冻过程，同时提升细胞膜的通透性，增加细胞内离子浓度，减小冰晶的形成，进而有效保护细胞。

贴壁细胞冻存操作步骤

1. 预热冻存液。
2. 用PBS冲洗细胞，添加胰酶进行消化（此步骤同细胞传代操作）。
3. 消化结束后重悬细胞，转移至无菌EP管，并以1000rpm离心5分钟。
4. 弃去上清液，加入预热的细胞冻存液，最佳冻存密度为5×10⁶~1×10⁷/ml，通常不低于5×10⁵/ml。
5. 分装完成后，拧紧冻存管盖并做好标记。
6. 将冻存管转入程序降温盒，放置于-80℃冰箱中过夜。
7. 将冻存管移至液氮中进行长期保存。

悬浮细胞冻存操作步骤

1. 使用移液管将细胞悬液充分混匀，并移入离心管中。
2. 以1000rpm离心3分钟，收集细胞沉淀。
3. 使用预热的冻存液重悬细胞，最佳冻存密度为3-5×10⁶/ml，通常不低于5×10⁵/ml。
4. 分装后拧紧冻存管盖并做好标记。
5. 将冻存管转入程序降温盒，放置于-80℃冰箱中过夜。
6. 最终将冻存管转移至液氮进行长期保存。

注意事项

• 在细胞培养、传代和冻存过程中，必须严格遵循无菌操作规范。
• 进行传代时，消化要适度，消化的时间受消化液、配制时间及加入量影响，需密切关注细胞形态变化，及时终止消化。
• 传代应在细胞处于对数生长期、未达汇合状态时进行。
• 细胞冻存液需提前配制，不可将DMSO直接加入细胞悬液中。
• 建议在细胞汇合度达到80%-90%且活力超过90%时进行冻存，以确保最佳冻存状态，冻存密度可根据细胞特性进行调整。
• 程序冻存盒、细胞冻存液和完全培养基等需提前复温至室温备用。
• 注意控制消化时间、吹打力度、离心转速和时间，以免损伤细胞。
• 确保冻存管盖拧紧，以防止水浴复苏时的污染。
• 细胞不应在-80℃冰箱中长期保存，最长不超过3天。
• 如果液氮或冰箱距离细胞房较远，需将细胞置于干冰或冰盒中运输。

通过上述操作流程与注意事项，俄罗斯专享会294致力于提供高质量的细胞冻存服务，确保细胞的长期保存及后续实验的顺利进行。