步骤一：试剂处理

1）从冰箱取出试剂；
2）缓慢解冻至室温；
3）轻轻颠倒混匀，以避免泡沫产生；
4）在低速离心后，即可使用。

技巧提示：在混匀时，请尽量避免产生气泡，因为气泡可能会影响酶的活性或实验结果的准确性。

步骤二：稀释步骤

1）若需追踪模板，请按以下步骤进行稀释；
2）如不需要追踪模板，则可直接用无菌超纯水稀释cDNA或直接使用cDNA原液。

系统配置举例

常见的荧光定量仪器为96孔反应，大致分为12列×8行。
例如，大体系的配制组分单孔量建议如下：
- HieffUNICON®ColorGPSqPCRMasterMix 10μL
根据孔数n，选择n+1或n+2的总数（每孔18μL），配成一个大体系。

实例：
- 正向引物（10μM）0.4μL，
- 反向引物（10μM）0.4μL，
- RNase-free H2O 7.2μL,
按照上述配置，加2μL cDNA模板以检测不同样本的基因1。

基因1的单孔配置

对应单孔量的步骤：
- 配置大体系Mix 18μL，
- cDNA模板 2μL。

完成加样后，将管盖盖严，用手轻轻弹击管壁，以确保试剂充分混匀，再放入小型离心机短暂离心1-2秒，确保无气泡后置于洁净的96孔PCR管架。

上机前的准备

在实验前，仔细检查管子，确保管盖和管身没有笔迹染料，且内部无气泡、管壁上无液体。对此要求特别注意，以避免实验数据出现偏差。

程序设置

若采用常规程序，设置如下：
循环步骤温度时间循环数
- 预变性 95℃ 2分钟 1次
- 变性 95℃ 10秒 40次
- 退火/延伸 60℃（根据引物TM值和目标基因长度）30秒
熔解曲线阶段：仪器默认设置 1。

若采用快速程序，请确认仪器有快速升降温的功能。以ABIQ5为例，设置如下：
循环步骤温度时间循环数
- 预变性 95℃ 30秒 1次
- 变性 95℃ 3秒 40次
- 退火/延伸 60℃（根据引物TM值和目标基因长度）10秒
熔解曲线阶段：仪器默认设置 1。

数据处理

得到的Excel数据可以进行如下处理，以确保质量和准确性。

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